一、主流示蹤方法（原理 + 適用 + 操作要點）

1. 親脂性熒光染料標記（常用、易操作）

• 染料：PKH26（紅）、PKH67（綠）、DiI、DiD、DiR（近紅外，適合活體）

• 原理：插入外泌體脂質雙層膜，熒光穩定、不影響膜結構

• 適用：體外細胞攝取、活體成像（DiR）、共聚焦 / 熒光顯微鏡

• 標準流程（DiD 為例）

1. 純化外泌體（超速離心 / 試劑盒），BCA 定量（100 μg 蛋白）

2. 加 DiD 母液至終濃度5 μM，37℃避光震蕩（200 rpm）孵育4 h

3. 超速離心（120,000×g，4℃，90 min）去游離染料，PBS 重懸

4. 過 PD-10 脫鹽柱純化，檢測粒徑（PDI<0.2）與回收率（≥80%）

• 關鍵對照：染料 - only 對照（排除游離染料干擾）

2. 遺傳工程標記（穩定、可靠）

• 方法：構建CD63-GFP/CD9-mCherry等外泌體標志物融合質粒，慢病毒 / 質粒轉染供體細胞，細胞分泌帶熒光的外泌體

• 原理：熒光蛋白與外泌體膜蛋白共表達，信號穩定、無染料毒性

• 適用：示蹤、體內分布、機制研究（無染料干擾）

• 操作：轉染→篩選穩轉株→收集上清→提取外泌體→直接示蹤

• 優勢：100% 標記、無游離信號、結果可信

3. 胞內酶切標記（間接示蹤）

• 染料：CFSE、Calcein-AM

• 原理：標記供體細胞，細胞分泌外泌體時攜帶熒光，間接示蹤

• 適用：快速篩選、初步驗證，不適合定量

4. 其他示蹤（進階）

• 核酸標記：熒光 siRNA/miRNA 載入外泌體，追蹤核酸遞送

• 磁性標記（SPIO）：超順磁性氧化鐵標記，MRI/MPI 活體深層成像

• 放射性標記（??Zr/???Tc）：PET/SPECT 定量體內分布、藥代動力學

二、標準實驗流程（體外 + 體內）

（一）體外細胞攝取實驗（共聚焦 / 流式）

1. 外泌體標記：選 PKH26/DiD/CD63-GFP，純化去游離染料

2. 細胞鋪板：共聚焦皿 / 6 孔板，密度 5×10? cells/cm2，貼壁 16 h

3. 孵育：無血清培養基稀釋標記外泌體（10–200 μg/mL），37℃孵育 0–24 h（設時間梯度）

4. 洗滌：PBS 洗 3 次，4% 多聚甲醛固定 15 min

5. 染色：DAPI 染核、Phalloidin 染肌動蛋白

6. 成像 / 檢測：共聚焦顯微鏡（定位）、流式細胞術（定量攝取率）

（二）體內示蹤（小鼠模型）

1. 標記：DiR（近紅外）或放射性標記外泌體

2. 給藥：尾靜脈 / 腹腔 / 瘤內注射（劑量：100–200 μg / 只）

3. 成像：小動物活體成像儀（IVIS），0、2、6、12、24 h 動態采集

4. 取材：處死小鼠，取主要器官（心、肝、脾、肺、腎、腫瘤），離體成像

5. 驗證：免疫熒光 / WB 檢測器官內外泌體標志物（CD63/CD81）