骨組織切片及trap染色實驗步驟

1、 骨組織脫鈣:新鮮骨組織固定于4%多聚jia醛24h以上，將組織從固定液取出置于EDTA脫鈣液內脫鈣(不能用含酸的脫鈣液脫鈣)，每3天換一次脫鈣液，至骨組織針扎可以順利通過為止。

2、 取材:在通風櫥內用**刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應的標簽放于脫水盒內。

3、 脫水:將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水醇 30min-無水/醇ll30min-醇苯5-10min-二甲苯|5-10min-二甲苯ll5-10min-蠟| 1h-蠟|| 1h-蠟Il1h.

4、 包埋:將浸好蠟的組織于包埋*內進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽。于-20°凍臺冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。

5、 切片:將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4um。 切片漂浮于攤片機40℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組只撈起，并放進60°℃烘箱內烤片，待水烤干蠟烤化后取出常溫保存備用。

6、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯I20min二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇I10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精

5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

7、染液配制:A液:0.1mol/L醋酸緩沖液PH5.0:醋酸Na1.3608q+蒸餾水100ml溶解，用Bing醋酸調PH值到5.0。B液:六偶氨副品紅 4%業肖酸Na:2g亞當酸Na+去離子水50ml副品紅溶液:副品紅2.5q+去離子水50ml+濃鹽酸7.5ml，加熱至90°溶解后過濾，4°棕色瓶保存。臨用前4%亞肖酸Na與副品紅溶液等比例混合。C液:萘酚AS-Bl磷酸酯20mg+N.N-2甲基甲酰胺1ml溶解。孵育液配制:A液18ml+B液1ml+C液1ml混勻，用1MNaOH或1M鹽酸調pH至5.0，再加酒石酸鉀Na0.282q，充分溶解過濾后備用即為TRAP孵育液。

8、 染色;切片詈干TRAP孵育液內37°孵育50min，鏡下觀察破骨細胞呈灑紅色為止，蒸餾水酒洗。

9、蘇木素染細胞核:切片入Harris蘇木素染3-8min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨,水返藍，流水沖洗。

10、脫水封片:將切片依次放入95%酒精l5min-95%酒精l5min-無水/醇I5min-無水/醇T5min-甲苯15min-單

苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

11、 顯微鏡鏡檢，冬像采集分析。

染色結果:破骨細胞胞漿呈酒紅色，核藍色。