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細胞周期檢測技術實驗步驟
實驗共分以下4個主要步驟:
1.細胞鋪盤
HeLa S3細胞，密度為80%左右分盤，使鋪盤密度在50%左右，為滿足流式細胞儀上機要求，細胞數目需大于1x10°/組。
2.細胞同步化處理:
a)加入終濃度2mM的Thymidine同步化18h
b) 用溫育的PBS洗4次，更換新鮮培養基，培養9h
c) 再加入2mM Thymidine再次同步化18h后
3.樣品收集 ;
a) 分別收取釋放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)細胞樣品
b) 每個樣品收取都使用預冷的PBS洗滌4次，1000g離心5min，棄上清
c) 100uL PBS重懸沉淀，吸取出細胞懸液于移液器中，于移去細胞的管中加入900uL預冷的70%乙醇，漩渦振蕩器震蕩中滴
入細胞懸液。
d)4℃固定一小時或更長時間。
e)1500rmp，離心10min，去固定液。
f)細胞染色液配制:50xRNaseA母液:50xPI母液:PBS=20:20:960;RNaseA母液濃度1mg/mL，工作濃度20ug/mL;PI母液濃度2.5mg/mL，工作濃度50ug/mL。
g) 細胞37度染色1h。根據細胞量，加入一定體積的細胞染色液(1~1.5mL)重懸，使上機時細胞通過率為200~350Cell/s,染色液不可過多或過少，過多則細胞密度過低上機速度嚴重不足，過少則導致細胞粘結。
h) 300目篩網過濾至流式管中。
4.上機檢測;
流式細胞儀上機檢測，計數50000個細胞。
5.同步化數據分析
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