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鬼筆環(huán)肽染色技術服務

簡要描述:鬼筆環(huán)肽,從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿,C35H48N8O11S。無色,細針狀結晶,系從毒曹類鬼筆鵝膏中得到的有毒的環(huán)狀七肽。

  • 更新時間:2026-03-21
  • 廠商性質:代理商
  • 訪  問  量:1083

詳細介紹

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染色原理

  1. 高特異性與親和力:Kd 約 20nM,嵌入 F-actin 亞基間的溝槽,穩(wěn)定微絲、抑制解聚;不結合 G-actin;對動植物多種肌動蛋白亞型均適用。

  2. 熒光偶聯(lián):常標記 FITC、TRITC、Alexa Fluor 488/568 等染料;無需抗體,直接染色,信號均勻、背景低。

  3. 膜不可透:必須固定 + 透化處理,不能用于活細胞;甲醇固定會嚴重破壞肌動蛋白絲,嚴禁使用,優(yōu)先 4% 多聚甲醛(無甲醇)。

標準實驗流程(貼壁細胞)

  1. 樣品準備:細胞爬片 70–80% 匯合;PBS 輕柔洗 2–3 次。

  2. 固定:加 4% 多聚甲醛(PBS 配制),室溫 15min;PBS 洗 3 次 ×5min。

  3. 透化:0.1–0.5% Triton X-100/PBS,室溫 5–10min;PBS 洗 3 次 ×5min;可加 1% BSA 封閉 15min 以降低非特異結合。

  4. 鬼筆環(huán)肽孵育:避光條件下,加 100nM 熒光鬼筆環(huán)肽工作液(PBS+1% BSA),室溫 30–60min;PBS 洗 3 次 ×5min。

  5. 核復染(可選):DAPI/Hoechst 染 10min,PBS 洗 2 次。

  6. 封片與鏡檢:用抗熒光淬滅封片劑封片,熒光 / 共聚焦顯微鏡觀察(對應染料濾光片)。

試劑配制與儲存

  • 儲存液:鬼筆環(huán)肽粉末用無水甲醇 / DMSO 溶解至 20–100μM,分裝,-20℃避光凍存,避免反復凍融;

  • 工作液:實驗前用含 1% BSA 的 PBS 稀釋至 50–200nM(常用 100nM);

  • 固定液必須無甲醇;透化時間因細胞類型調(diào)整。

應用場景

  1. 細胞骨架形態(tài)觀察(應力纖維、皮層微絲、絲狀偽足、板狀偽足);

  2. 細胞遷移、極性、分裂、侵襲實驗的骨架變化評估;

  3. 藥物 / 基因干擾對肌動蛋白重組的影響;

  4. 組織切片中肌纖維 / 內(nèi)皮細胞骨架成像。

關鍵注意事項與常見問題

  1. 毒性:鬼筆環(huán)肽有毒,操作需戴手套、在通風櫥中進行;

  2. 固定禁忌:甲醇 / 丙酮固定會破壞 F-actin,導致染色失敗;

  3. 背景高:多是未充分洗滌、封片有氣泡、染料濃度過高;可延長洗滌、降低工作濃度、增加 BSA 封閉;

  4. 熒光淬滅:用抗淬滅封片劑、縮短曝光、及時觀察、4℃避光保存樣品;

  5. 無信號:透化不足(試劑進不去)或固定過度(蛋白交聯(lián)嚴重);優(yōu)化透化 / 固定時間。

組織切片 / 石蠟樣本的額外步驟

  1. 脫石蠟、梯度乙醇復水;

  2. 抗原修復(檸檬酸鹽緩沖液,微波 / 水浴);

  3. 后續(xù)流程同細胞:固定→透化→封閉→鬼筆環(huán)肽→核染→封片。

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