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底層瓊脂：起支撐作用
上層瓊脂：細胞懸浮其中，無法貼壁
只有惡性程度高 / 腫瘤干細胞樣的細胞能在懸浮狀態下增殖形成肉眼可見的克隆。
2× 培養基（含 20% FBS）
1.2% 低熔點瓊脂糖（底層）
0.7% 低熔點瓊脂糖（上層）
6 孔板
1.2% 瓊脂: 2× 培養基 = 1:1混合（終濃度 0.6%）
每孔加 2 mL，室溫凝固
0.7% 瓊脂: 2× 培養基 = 1:1混合（終濃度 0.35%）
加入細胞懸液，混勻
細胞密度：1×103~1×10? / 孔
每孔加 1~1.5 mL，室溫凝固
37℃、5% CO? 培養 14~21 天
每 3～4 天滴加少量培養基保濕
PBS 輕洗
結晶紫或 MTT 染色
顯微鏡下計數直徑＞50~100 μm的克隆數
克隆數越多、體積越大 → 惡性程度 / 成瘤能力越強
給藥組克隆數減少 → 抑制惡性表型
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