一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備?

1. ?試劑與耗材?

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：α-MEM或DMEM-LG（含10%胎牛血清、1%雙抗）
  

• 分離液：Percoll密度梯度液（1.073 g/ml）或直接使用全骨髓貼壁法
  

• 器械：眼科剪、鑷子、1ml注射器（4.5號(hào)針頭）、200目細(xì)胞篩
  

2. ?動(dòng)物處理?

• 選擇4-6周齡BALB/c小鼠或SD大鼠，脫臼處死后75%酒精浸泡5分鐘
  

?二、骨髓細(xì)胞提取?

1. ?骨髓沖洗?

• 剝離股骨/脛骨，剔除肌肉組織，用注射器（含培養(yǎng)基）沖洗骨髓至離心管
  

• 關(guān)鍵點(diǎn)：需強(qiáng)力沖洗3-5次以提高細(xì)胞得率（單鼠可得約7×10?個(gè)細(xì)胞）
  

2. ?細(xì)胞分離（二選一）?

• ?密度梯度法?：骨髓懸液疊加Percoll液，2500rpm離心25分鐘，吸取白膜層
  

• ?全骨髓法?：直接過濾后接種，48小時(shí)后換液去除未貼壁細(xì)胞
  

?三、原代培養(yǎng)?

1. ?接種參數(shù)?

• 密度：1×10? cells/ml（T25培養(yǎng)瓶）或2.5×10? cells/ml（培養(yǎng)皿）
  

• 條件：37℃、5% CO?，次換液時(shí)間為接種后3小時(shí)（去除紅細(xì)胞）
  

2. ?后續(xù)處理?

• 每2-3天換液，7-10天可見梭形貼壁細(xì)胞（純度約60-70%）
  

• 傳代：80%融合時(shí)用0.25%Pancreatin?消化，傳代比例1:2
  

?四、注意事項(xiàng)?

• ?污染控制?：超凈臺(tái)紫外滅菌30分鐘，操作中頻繁火焰消毒器械
  

• ?形態(tài)鑒別?：原代BMSCs呈紡錘形，混雜造血干細(xì)胞呈圓形（需通過換液逐步去除）
  

• ?血清選擇?：建議使用批次驗(yàn)證的胎牛血清（濃度可提升至15%促進(jìn)初期貼壁）
  

?五、應(yīng)用場景?

• ?分化研究?：成骨/成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)需從P1代開始
  

• ?臨床潛力?：用于軟骨修復(fù)或神經(jīng)再生治療

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