蛋白質(zhì)N-糖基化修飾及其研究的意義

蛋白質(zhì) N-糖基化修飾在生物體中非常重要，蛋白質(zhì)N-糖基化修飾影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定性、細(xì)胞定位、受體-配體相互作用等。它的研究也一直是蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)與疾病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。N-糖基化研究能解釋“為什么同一個(gè)蛋白在不同情況下功能不同"： 同一種蛋白，即使氨基酸序列相同，N-糖基化位點(diǎn)的占據(jù)率與糖型組成仍會(huì)隨細(xì)胞狀態(tài)變化而變化。蛋白質(zhì)N-糖基化修飾對(duì)疾病機(jī)制與生物標(biāo)志物開發(fā)尤為關(guān)鍵：N-糖基化與多種疾病密切相關(guān)：

? 癌癥：腫瘤常伴隨糖基化加工失衡，出現(xiàn)糖型重塑，影響腫瘤生長、侵襲、免疫逃逸。

? 免疫疾病：糖型改變會(huì)影響免疫細(xì)胞受體功能與免疫識(shí)別。

? 遺傳與罕見病：糖基化通路酶或轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因異常會(huì)導(dǎo)致廣泛的蛋白錯(cuò)誤折疊與功能缺陷。

? 感染與炎癥：病原體與宿主之間的糖識(shí)別、炎癥信號(hào)都可能涉及 N-糖基化變化。

如何進(jìn)行蛋白質(zhì)N-糖基化修飾研究

蛋白質(zhì) N-糖基化（N-glycosylation） 的研究通常要覆蓋：位點(diǎn)鑒定→ 糖型（結(jié)構(gòu)）分析 → 蛋白表達(dá)（折疊/表達(dá)/定位/穩(wěn)定性等）→ 功能或通路驗(yàn)證。目前常用的驗(yàn)證策略如下

1) 設(shè)計(jì)突變

對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的 Asn進(jìn)行突變，做至少三組：WT（野生型）、單突變（每個(gè)位點(diǎn)各自）、多位點(diǎn)突變/組合突變（如果多個(gè)位點(diǎn)貢獻(xiàn)疊加）。

2) N-糖基化對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

n 表達(dá)量（Western/ELISA/流式）

n 蛋白穩(wěn)定性（Cycloheximide追蹤或蛋白半衰期）

n 亞細(xì)胞定位（免疫熒光/流式表面染色/分級(jí)提取）

n 整體折疊狀態(tài)（必要時(shí)做構(gòu)象抗體或SEC/DSF）

3) 根據(jù)你的蛋白功能選擇合適功能實(shí)驗(yàn)，例如：

n 酶活（底物底物法）

n 受體/配體結(jié)合（SPR/BLI/共沉淀）

n 信號(hào)通路激活（報(bào)告基因 ）

n 運(yùn)輸/分泌（分泌量、細(xì)胞表面水平）

n 細(xì)胞表型（增殖、遷移、凋亡等；最好回到分子層面）

4) 抑制糖基化或者類型

n 抑制糖鏈合成/轉(zhuǎn)移：使 N-糖基化整體減少或改變

n 抑制特定糖基化酶：例如巖藻糖轉(zhuǎn)移酶等

n 抑制加工（ER→Golgi）：改變糖型成熟度

案例分享——PD-1

1. PD-1是高度糖基化修飾的蛋白質(zhì)

PD-1（Programmed cell death-1，程序性死亡受體1）是腫瘤免疫治療中最核心的免疫檢查點(diǎn)之一。PD-1是一種表達(dá)在免疫細(xì)胞表面的抑制性免疫檢查點(diǎn)受體。它的主要作用是幫助機(jī)體在免疫反應(yīng)過強(qiáng)時(shí)“剎車"，維持免疫穩(wěn)態(tài)；但在腫瘤中，PD-1 通路會(huì)被利用來讓腫瘤逃避免疫清除。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 在 N49、N58、N74 和 N116 位置發(fā)生 N-連接糖基化，這一過程由糖基轉(zhuǎn)移酶 B3GNT2 促進(jìn)。此外，PD-1 的核心巖藻糖糖基化發(fā)生在 N49 和 N74 位點(diǎn)，由核心巖藻糖糖基轉(zhuǎn)移酶 FUT8 介導(dǎo)。此外，PD-1 在 T153、S157、S159 和 T168 位點(diǎn)發(fā)生 O-連接糖基化。

圖1 PD-1 的糖基化和巖藻糖化調(diào)控的示意圖

2. N-糖基化修飾對(duì)PD-1的影響研究案例

盡管使用單克隆抗體進(jìn)行PD-1 阻斷治療在臨床上取得了成功，但大多數(shù)患者對(duì)這種治療沒有反應(yīng)，而PD-1 的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制仍未wan全明確。

作者通過突變、功能實(shí)驗(yàn)等，表明 PD-1在T細(xì)胞中廣泛進(jìn)行N-糖基化，并且其特定糖型的強(qiáng)度在TCR 激活后會(huì)發(fā)生變化；糖基化對(duì)于維持 PD-1 蛋白的穩(wěn)定性和細(xì)胞表面定位至關(guān)重要；PD-1的糖基化，尤其是 N58 位點(diǎn)的糖基化，對(duì)于介導(dǎo)其與 PD-L1的相互作用是bi不可少的。

此外作者基于目前PD-1靶向治療的局限性，設(shè)計(jì)單克隆抗體 STM418 特異性靶向糖基化的PD-1，其與PD-1 的結(jié)合親和力高于已獲批的PD-1抗體，能有效抑制PD-L1/PD-1結(jié)合，并增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。這些研究結(jié)果共同揭示了PD-1葡糖基化的功能意義，并為將葡糖基化的PD-1作為免疫治療潛在策略加以靶向提供了理論依據(jù)。文章整體設(shè)計(jì)及結(jié)果如下所示：

圖2 文章設(shè)計(jì)及結(jié)果總結(jié)