細(xì)胞“自噬"的新秘鑰：看“棕櫚酰化"如何解鎖自噬體形成的奧秘

研究背景

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種通過雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹并降解細(xì)胞質(zhì)成分（如錯誤折疊蛋白、損傷細(xì)胞器和入侵微生物）的降解途徑，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞發(fā)育、免疫反應(yīng)和細(xì)胞死亡至關(guān)重要，其失調(diào)與癌癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。自噬體的形成由ATG蛋白調(diào)控，其中ATG16L1是關(guān)鍵蛋白，它與ATG12-ATG5結(jié)合形成復(fù)合物，催化LC3脂化，促進(jìn)自噬體形成，并參與細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌隔離、線粒體自噬及炎癥調(diào)節(jié)。S-棕櫚酰化是一種可逆的翻譯后修飾，通過在半胱氨酸殘基上添加棕櫚酰基團(tuán)，影響蛋白質(zhì)相互作用和膜結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白功能。

本篇文獻(xiàn)“ZDHHC 7介導(dǎo)的ATG 16 L1的S-棕櫚酰化促進(jìn)LC 3脂化和自噬體形成"，主要為了探索ATG16L1的S-棕櫚酰化位點及其對LC3脂化和自噬體形成的影響，以期闡明自噬調(diào)控機(jī)制。

研究內(nèi)容

1. ATG16L1發(fā)生S-棕櫚酰化

首先，通過酰基生物素交換（ABE）實驗檢測ATG16L1的S-棕櫚酰化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)HEK293T細(xì)胞中的內(nèi)源性ATG16L1以及MCF7細(xì)胞中過表達(dá)的ATG16L1均顯示出明顯的生物素信號，表明ATG16L1是一個S-棕櫚酰化蛋白。此外，使用棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸（2-BP）處理細(xì)胞可顯著降低ATG16L1的修飾水平，進(jìn)一步證實了其S-棕櫚酰化狀態(tài)。實驗還發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)（EBSS和Torin 1）可顯著增加ATG16L1的S-棕櫚酰化水平，而自噬抑制（VPS34-IN1）則降低其S-棕櫚酰化水平，表明ATG16L1的S-棕櫚酰化響應(yīng)自噬信號。

2. ATG16L1的S-棕櫚酰化位點

為了確定ATG16L1的S-棕櫚酰化位點，研究者構(gòu)建了多個截短突變體和位點突變體。通過ABE實驗，發(fā)現(xiàn)ATG16L1的Cys153是主要的S-棕櫚酰化位點。突變該位點（C153S）后，ATG16L1的S-棕櫚酰化水平顯著降低，表明Cys153是關(guān)鍵的修飾位點。

3. ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化的影響

作者利用ATG16L1基因敲除（KO）HeLa細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ATG16L1的缺失導(dǎo)致LC3-II的缺失，而重新表達(dá)野生型ATG16L1可恢復(fù)LC3-II的生成。然而，表達(dá)S-棕櫚酰化缺陷的ATG16L1-C153S突變體則無法恢復(fù)LC3-II的生成。在自噬誘導(dǎo)（EBSS或Baf-A1）條件下，野生型ATG16L1可顯著促進(jìn)LC3-II的生成，而ATG16L1-C153S突變體則無法響應(yīng)自噬誘導(dǎo)，表明ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化過程至關(guān)重要。

4. ATG16L1的S-棕櫚酰化對自噬體形成的影響

通過在ATG16L1-KO HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3，并重新表達(dá)野生型ATG16L1或ATG16L1-C153S突變體，研究者發(fā)現(xiàn)野生型ATG16L1可顯著增加EGFP-LC3點狀結(jié)構(gòu)（自噬體標(biāo)記）的數(shù)量，而ATG16L1-C153S突變體則無法恢復(fù)自噬體的形成。進(jìn)一步通過GFP-RFP-LC3雙熒光實驗和透射電子顯微鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)，野生型ATG16L1可促進(jìn)自噬體和自噬溶酶體的形成，而ATG16L1-C153S突變體則無法促進(jìn)這些結(jié)構(gòu)的形成。此外，實驗還表明ATG16L1的S-棕櫚酰化缺陷不影響吞噬體的形成，但會抑制自噬體的成熟。

5. ZDHHC7介導(dǎo)ATG16L1的S-棕櫚酰化

接著，通過共免疫沉淀（Co-IP）實驗發(fā)現(xiàn)，ZDHHC7與ATG16L1相互作用，并且這種相互作用在自噬誘導(dǎo)條件下增強(qiáng)。進(jìn)一步實驗表明，ZDHHC7過表達(dá)可顯著增加ATG16L1的S-棕櫚酰化水平，而ZDHHC7的催化活性位點突變體（ZDHHC7-C160S）則無法促進(jìn)ATG16L1的S-棕櫚酰化。在ZDHHC7基因敲除（KO）細(xì)胞中，ATG16L1的S-棕櫚酰化水平顯著降低，而重新表達(dá)ZDHHC7可恢復(fù)ATG16L1的S-棕櫚酰化，表明ZDHHC7是ATG16L1 S-棕櫚酰化的關(guān)鍵酶。

6. ZDHHC7介導(dǎo)的ATG16L1 S-棕櫚酰化對自噬的影響

在ZDHHC7-KO細(xì)胞中，LC3-II的生成和自噬體的形成受到抑制，而重新表達(dá)ZDHHC7可恢復(fù)這些過程，而ZDHHC7-C160S突變體則無法恢復(fù)。此外，ZDHHC7過表達(dá)可促進(jìn)LC3-II的生成和自噬體的形成，而ZDHHC7-KO則抑制這些過程。這些結(jié)果表明ZDHHC7介導(dǎo)的ATG16L1 S-棕櫚酰化在LC3脂化和自噬體形成中發(fā)揮重要作用。

7. ATG16L1的S-棕櫚酰化對其相互作用的影響

研究者發(fā)現(xiàn)，ATG16L1的S-棕櫚酰化對其與WIPI2B和RAB33B（WIPI2B通過招募ATG16L1復(fù)合物促進(jìn)LC3脂化，而RAB33B則通過運輸ATG16L1復(fù)合物確保其在吞噬體上的定位）的相互作用具有顯著影響。野生型ATG16L1與WIPI2B和RAB33B的相互作用強(qiáng)于S-棕櫚酰化缺陷的ATG16L1-C153S突變體。此外，ZDHHC7過表達(dá)可增強(qiáng)ATG16L1與WIPI2B和RAB33B的相互作用，而2-BP處理則削弱這種相互作用。這些結(jié)果表明，ATG16L1的S-棕櫚酰化通過增強(qiáng)其與WIPI2B和RAB33B的相互作用，促進(jìn)ATG16L1復(fù)合物在吞噬體上的募集，從而促進(jìn)LC3脂化和自噬體的形成。

研究結(jié)論

本研究揭示了ZDHHC7介導(dǎo)的ATG16L1 S-棕櫚酰化通過增強(qiáng)其與WIPI2B和RAB33B的相互作用，促進(jìn)LC3脂化和自噬體的形成，從而為自噬的調(diào)控提供了新的分子機(jī)制。

Wei F, Wang Y, Yao J, Mei L, Huang X, Kong H, Chen J, Chen X, Liu L, Wang Z, Wang J, Song J, Kong E, Yang A. ZDHHC7-mediated S-palmitoylation of ATG16L1 facilitates LC3 lipidation and autophagosome formation. Autophagy. 2024 Dec;20(12):2719-2737. doi: 10.1080/15548627.2024.2386915. Epub 2024 Aug 11. PMID: 39087410; PMCID: PMC11587844.